Стрептавидин Сигма CAS 9013-20-1

1. Познакомьтесь со стрептавидином
Стрептавидин (SA), секретируемый белок, полученный из Streptomyces avidinii, имеет молекулярную массу примерно 65-66 кДа и изоэлектрическую точку около 6,0. Это тетрамерный белок, состоящий из четырех гомологичных субъединиц, каждая из которых имеет независимый сайт связывания биотина. Это означает, что одна молекула стрептавидина может одновременно связываться с четырьмя молекулами биотина. Константа диссоциации (Kd) между ними составляет всего около 10 ⁻¹⁵ M, что является одним из самых сильных известных нековалентных биологических взаимодействий и может рассматриваться как наиболее точный «механизм молекулярной блокировки» в природе.

По сравнению с авидином, полученным из яичного белка, он обладает непревзойденными преимуществами:

Он не содержит модификаций гликозилирования, в целом электрически нейтрален, поэтому имеет чрезвычайно низкое не-специфическое связывание в физиологических условиях, чистый экспериментальный фон и отличное соотношение сигнал-/-шум. Кроме того, его превосходная устойчивость к денатурации и протеазной деградации, а также его способность выдерживать экстремальные значения pH, высокие температуры (70-80 градусов C), органические растворители и обычные денатурирующие агенты (такие как SDS и мочевина) заменили авидин и стали бесспорным «золотым стандартом» в системах связывания биотина.

Именно благодаря этим выдающимся характеристикам он блистает в таких областях, как науки о жизни, диагностика in vitro, скрининг лекарств и биосенсорство.

2. Иммунное тестирование
Применение в области иммунного обнаружения является наиболее классическим и широко используемым. С момента своего создания в конце 1970-х годов биотин-стрептавидиновая система (BAS) стала краеугольным камнем иммунного мечения и анализа отслеживания благодаря своему сверхвысокому сродству и эффекту каскадной амплификации. По статистике, около 85% распространенных хемилюминесцентных анализаторов используют методы детектирования на основе BAS, что указывает на их доминирующее положение.

2.1 Иммуноферментный анализ (ИФА)

В ИФА можно объединить пероксидазу хрена (HRP) или щелочную фосфатазу (AP), и фермент можно точно направить к мишени с помощью биотинилированных антител. HRP катализирует люминесцентные субстраты TMB, DAB или ECL для получения мощных химических или оптических сигналов, тогда как AP катализирует BCIP/NBT, PNPP и другие субстраты для получения стабильного цвета или сигналов хемилюминесценции. Биотинилированная молекула-мишень может связываться с многократно меченным стрептавидином, обеспечивая многоуровневое усиление сигнала и делая возможным обнаружение мишеней с низким содержанием. Эта технология широко используется в сэндвич- и конкурентном ИФА, охватывая такие сценарии, как количественный анализ белка, обнаружение антител, скрининг патогенов и т. д.

2.2 Иммуноблоттинг белков (Вестерн-блоттинг)
При вестерн-блоттинге связывание с биотинилированными вторичными антителами может значительно повысить интенсивность сигнала белков-мишеней на пленках-переносчиках. По сравнению с традиционными системами вторичных антител, системы BAS могут обеспечить более сильное усиление сигнала благодаря своим свойствам четырехвалентного связывания. Кроме того, из-за низкого не-специфического связывания стрептавидина значительно снижается фоновое вмешательство, что делает их особенно подходящими для количественного анализа белков с низким содержанием.

2.3 Иммуногистохимия (ИГХ) и иммуноцитохимия (ИКЦ)
Стрептавидин, меченный HRP или AP, является предпочтительным инструментом амплификации сигнала для ИГХ и ИКК. Система HRP подходит для экспериментов, требующих чрезвычайно высокой чувствительности обнаружения, а система AP особенно подходит для систем, содержащих ингибиторы HRP (таких как азид натрия), или для экспериментальных сценариев, требующих длительного-развития цвета и стабильности сигнала. Связывая биотинилированные зонды или антитела с конъюгатами стрептавидина, молекулы-мишени можно точно локализовать в срезах тканей или образцах клеток.

2.4 Иммунофлуоресценция (IF) и гибридизация in situ (ISH)

Стрептавидин, меченный флуоресцеином (например, FITC-стрептавидин, PE-стрептавидин, APC-стрептавидин), является универсальным инструментом визуализации для иммунофлуоресцентного окрашивания и гибридизации in situ. Маркер FITC имеет длину волны возбуждения/эмиссии примерно 494/519 нм и демонстрирует ярко-зеленую флуоресценцию; Длина волны возбуждения/эмиссии маркера PE составляет около 565/578 нм, что является «золотым стандартом» для анализа многоцветной проточной цитометрии; Маркер APC покрывает дальний красный спектр, облегчая создание многоцветных-изображений. Эти флуоресцентные маркеры могут точно связываться с биотинилированными антителами или зондами нуклеиновых кислот для проведения анализа локализации и количественного обнаружения молекул-мишеней.

2.5 Проточная цитометрия (FACS)

В проточной цитометрии флуоресцентно меченный стрептавидин (особенно меченный PE) используется для обнаружения антигенов клеточной поверхности, меченных биотинилированными антителами. Его превосходная яркость обеспечивает чрезвычайно высокое соотношение сигнал-/-шум, что позволяет эффективно обнаруживать популяции клеток с низкой экспрессией поверхностного антигена или слабыми сигналами. Это незаменимый реагент при анализе многоцветной проточной цитометрии.

2.6 Иммуносвязанный ферментный анализ (ELISPOT)
Стрептавидин, меченный AP, демонстрирует превосходные характеристики в ELISPOT и подходит для твердофазного анализа и систем окрашивания тканей/клеток. Он может стабильно катализировать выработку субстрата счетных точечных сигналов для обнаружения секреции цитокинов на уровне отдельных клеток.

3. Очистка белков и нуклеиновых кислот.
3.1. Аффинная хроматография и очистка белков
Стрептомицин является основным компонентом упаковки для аффинной хроматографии. После мечения биотином белка, подлежащего очистке, его смешивают со стрептавидин-агарозным гелем (таким как стрептавидин-агароза/сефароза), и меченый белок тесно связывается со стрептавидином на наполнителе. Путем промывки для удаления примесей, а затем промывки целевого белка в соответствующих условиях (таких как кипящий буфер SDS-PAGE, обработка 0,1% SDS или обработка 95% формамидом+10 мМ ЭДТА при pH 8,2) можно получить продукты высокой-чистоты.

Если взять в качестве примера промышленное производство рекомбинантного человеческого инсулина, то высококачественные магнитные шарики стрептавидина могут связывать более 1200 пмоль свободного биотина на миллиграмм, а чистота очищенного белка может достигать более 95 %.

3.2 Иммунопреципитация (ИП) и иммунопреципитация хроматина (ЧИП)
Применение магнитных шариков стрептавидина в иммунопреципитации значительно повышает эффективность эксперимента. Исследователи могут фиксировать биотинилированные антитела на магнитных шариках стрептавидина и совместно инкубировать их с клеточным лизатом.

Антитела специфически захватывают целевой белок и взаимодействующие с ним белки, образуя комплекс «белок-мишень магнитных шариков антитела». Его можно быстро отделить под действием внешнего магнитного поля, он прост в эксплуатации и имеет высокую чувствительность. В экспериментах ChIP магнитные шарики стрептавидина также использовались для захвата биотинилированных белковых комплексов ДНК и изучения взаимодействия между белками и ДНК.

3.3. Эксперимент с понижением
При изучении белок-белковых взаимодействий магнитные шарики могут захватывать биотинилированные белки-приманки, а затем «вылавливать» пребелки, которые с ними взаимодействуют. Например, при изучении ключевых сигнальных путей в опухолевых клетках специфические антитела, распознающие белок P53, иммобилизуют на магнитных шариках стрептавидина и совместно инкубируют с лизатом опухолевых клеток для эффективного обогащения P53 и связанных с ним белков. По сравнению с традиционными методами иммунопреципитации, IP с магнитными шариками обладает более высокой чувствительностью и специфичностью и может более эффективно обогащать целевые белки с низким содержанием.

3.4. Вытягивание РНК-вниз
Магнитные шарики также подходят для экспериментов по извлечению-РНК. После связывания с магнитными шариками стрептавидина биотинилированные зонды РНК могут захватывать белки, которые взаимодействуют с РНК из клеточных лизатов, для изучения сетей взаимодействия белков РНК.
3.5 Получение одноцепочечной ДНК и экстракция нуклеиновой кислоты
Он может связываться с биотинилированными олигонуклеотидами для получения одноцепочечной ДНК и эффективного извлечения нуклеиновых кислот, играя важную роль в молекулярном клонировании и генной инженерии.

4. Высокая производительность обнаружения и проверки на наркотики.
4.1. TR-Платформа тестирования FRET
Его можно сочетать с люминесцентными хелатами, такими как хелаты европия, для связывания сигналов и молекулярного захвата в системе обнаружения TR-FRET (разрешенная по времени флуоресцентная резонансная передача энергии). Например, THUNDER ™. Стрептавидин, меченный европием, специально разработанный для экспериментальной платформы TR-FRET, может стабильно связываться с различными биотинилированными модифицированными молекулами и широко используется в анализе взаимодействия белков и предварительном скрининге целевых лекарств.

Эта система является однородной и имеет высокую-производительность, что делает ее мощным инструментом для разработки современных лекарств.

4.2 Адресная доставка лекарств
Его свойства связывания биотина делают его идеальным носителем для систем целевой доставки лекарств. Соединяя молекулы лекарства с биотином и используя целенаправленную связывающую способность стрептавидина, можно добиться точной доставки лекарства, повышая эффективность лечения и уменьшая побочные эффекты.

4.3 Биосенсоры и биочипы

Это основной материал для производства биосенсоров и биочипов. Путем иммобилизации стрептавидина на поверхности чипа в качестве элемента захвата на нем можно иммобилизовать меченные биотином белковые зонды или антитела, обеспечивая высокую-пропускную способность и высокую-чувствительность обнаружения. Например, при раннем скрининге белковых чипов на сердечно-сосудистые заболевания магнитные шарики стрептавидина фиксируются на подложке чипа и используются для связывания биотинилированных белковых зондов. Это позволяет точно выявлять отклонения у пациентов на ранних стадиях заболевания и при концентрации маркеров в крови всего лишь 0,01 нг/мл, что расширяет диагностическое окно на 2-3 часа по сравнению с традиционными диагностическими методами.

5. Клеточная биология и визуализация
5.1 Маркировка клеточной поверхности и флуоресцентная сортировка клеток
Флуоресцентно меченный стрептавидин (например, стрептавидин Vari Fluor 488) широко используется для мечения клеточной поверхности и флуоресцентной сортировки клеток. Спектр его излучения охватывает весь спектр видимого и ближнего-инфракрасного света, а в экспериментах с многоцветной маркировкой он может легко проникать в структуру ядра и цитоплазмы, метить целевые белки для визуализации и анализа.

5.2. Нанотехнологии и самосборка материалов
Его четырехвалентные связывающие свойства делают его идеальным «мостом» для само-сборки наноматериалов. Благодаря целенаправленному связыванию биотина-стрептавидина можно создавать различные наноструктуры для междисциплинарных исследований, таких как биологическая визуализация и мониторинг окружающей среды.

6. Антитело против стрептавидина.
С широким использованием стрептавидин-биотиновой системы возникла проблема, которую часто упускают из виду: - эндогенные антистрептавидиновые антитела (ASA) в образце могут мешать работе системы обнаружения. Исследования показали, что связывание ASA с SA в реакционной системе может повлиять на правильное построение специфических систем антиген-антитело, что приводит к снижению точности связывания, обнаружения или результатов диагностики.

Для решения этой проблемы появились наборы для обнаружения антител к стрептавидину, которые можно использовать для обнаружения эндогенного АСК в образцах пациентов и предотвращения его взаимодействия с системой BAS. Компания Roche Custom Biotech разработала неактивный мутант стрептавидина (Streptavidin Rec. Inactive, Poly), который можно добавлять в текущую систему без дополнительных шагов для специфического блокирования и устранения помех ASA, улучшая точность и специфичность системы обнаружения.

7. Вмешательство биотина
Хотя стрептавидин-биотиновая система является мощной, она сталкивается со все более серьезной проблемой - вмешательства биотина.

Когда в тестируемом образце присутствует высокая концентрация свободного биотина, он конкурирует с биотинилированными антителами за место связывания стрептавидина, что приводит к искажению результатов обнаружения.

Пероральный прием 100 мг биотина может привести к достижению максимальной концентрации в плазме 375–450 нг/мл; Пациенты с рассеянным склерозом могут принимать 300 мг/день перорально, а уровень биотина в плазме может превышать 1000 нг/мл; Ежедневный прием 500 мг биотина может привести к чрезвычайно высокой концентрации биотина в крови. В сэндвич-иммуноанализе избыток биотина может привести к ошибочным заниженным результатам; В конкурентных иммуноанализах это может привести к ошибочно высоким результатам.

Многочисленные исследования показали, что ТТГ, тироксин-ПТГ, эндокринные тесты, такие как адренокортикотропный гормон, пролактин, тестостерон, кортизол, а также опухолевые маркеры и сердечные функциональные маркеры, в различной степени подвержены влиянию биотина. FDA последовательно выпускало предупреждающую информацию и соответствующие рекомендации. Стратегии решения проблемы включают в себя: серийное разведение образцов, переход на методы, не относящиеся к BAS, такие как жидкостная хроматография-масс-спектрометрия, повторное тестирование после выведения биотина (от 2 часов до 15 дней или даже месяцев) или использование свободных поглотителей биотина.