GLP-1(связь:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) — полипептидный гормон, состоящий из 30 аминокислот. Благодаря углубленным исследованиям GLP-1 было разработано все больше и больше синтетических методов. В этой статье будут систематически представлены известные в настоящее время методы синтеза GLP-1.
Способ 1, твердофазный синтез:
Твердофазный синтез является широко используемым методом синтеза пептидов и белков, а также широко используется для синтеза GLP-1. В твердофазном синтезе структура ядра формируется путем связывания первой аминокислоты со смолой. Затем последовательно добавляют следующую аминокислоту и подвергают химической реакции с соответствующим конденсирующим агентом. Наконец, целевой продукт может быть получен путем отщепления полипептида от смолы.
Важность твердофазного синтеза заключается в том, что он обеспечивает автоматизацию и крупномасштабное производство пептидного синтеза. Текущие основные методы твердофазного синтеза включают Fmoc и Boc. Среди них метод Fmoc использует защитную группу N-Fmoc для защиты пептида, тогда как метод Boc использует трет-бутилоксикарбонил для защиты карбоксильной группы.
Метод второй, жидкофазный синтез:
Жидкофазный синтез представляет собой традиционный метод синтеза пептидов, при котором реагенты помещают в жидкую фазу для проведения реакции. Преимущество жидкофазного синтеза заключается в том, что условия реакции мягкие и подходят для модификации чувствительных химических структур. Однако из-за слишком большого количества реагентов процесс очистки является относительно громоздким. К химическим реакциям жидкофазного синтеза относятся:
1. Реакция конденсации:
Реакция конденсации является одной из самых основных реакций в синтезе пептидов, то есть карбоксильная группа, инициируемая конденсирующими агентами, такими как DCC и HOBt, соединяется с аминогруппой аминокислоты посредством реакции ацилирования. Условия реакции мягкие, а выход высокий.
2. Реакции элиминации:
Реакция элиминации заключается в восстановлении метионина до дитиола с помощью NaBH4 и других восстановителей, что делает его неактивным. Реакцию необходимо проводить в основных условиях.
3. Удаление защитных групп:
Из-за различных функций аминокислот в пептидной цепи для защиты будут использоваться разные защитные группы. После завершения синтеза защитную группу необходимо удалить. Для метода Fmoc обычно используют пиперидин для удаления Fmoc; в то время как для Boc-метода TFA используется для удаления Boc.
Способ третий, химический синтез:
GLP-1 – это полипептидный гормон, обладающий важной биологической активностью. Его синтез можно осуществить различными методами, среди которых химический синтез является одним из наиболее часто используемых методов. Преимущество химического синтеза состоит в том, что он позволяет получать целевые продукты высокой степени чистоты, пригодные для крупнотоннажного производства. Метод химического синтеза и подробные этапы GLP-1 будут представлены ниже.
1. Синтетический маршрут и выбор защитной группы:
Молекула GLP-1 состоит из 36 аминокислот, включая 21 аминокислоту L-типа и 15 аминокислот D-типа. Перед проведением синтеза необходимо выбрать подходящий путь синтеза и выбрать соответствующую защитную группу в соответствии с условиями синтеза. Твердофазный синтез Fmoc обычно используется для автоматизированного крупномасштабного синтеза. В этом методе в качестве защитной группы используется защита N-9-фторимидокарбоксила (N-Fmoc), а также необходимо выбрать подходящую вторичную защитную группу (такую как трет-бутил или метил), чтобы обеспечить защиту определенных участков. Каждый раз, когда добавляется новая аминокислота, сначала необходимо удалить защитную группу Fmoc, а затем добавить защищенное связующее вещество следующей аминокислоты.
2. Синтез основной аминокислотной последовательности:
Основная последовательность GLP-1 состоит из 21 аминокислоты, включая ключевой серин и четыре последовательности дипептида пролилглутаминовой кислоты. В твердофазном синтезе синтез основной последовательности можно разделить на следующие этапы:
2.1. Добавьте карбамат уксусной кислоты (Fmoc-NH-CH2CO2Et) и 2-Cl-Trt-Cl к твердофазной синтетической смоле и проведите реакцию конденсации со связующим агентом DIC/NMM.
2.2. Удалите защитную группу Fmoc путем реакции снятия защиты с группы.
2.3. Добавьте следующую аминокислоту, последовательно повторите шаг 1 и шаг 2, пока не будет синтезирована основная последовательность.
2.4. Формирование пентапептидных структур на твердофазной смоле. Добавьте реагент ацетализации к твердофазной смоле, проведите реакцию с агентом распознавания N-конца (например, HBTU), добавьте защитную группу боковой цепи серина в качестве вспомогательного восстанавливающего агента, а затем удалите защитную группу Fmoc.
2.5. Под действием трансферазы Bacillus subtilis (ProTide) пентапептидная структура вступает в реакцию обмена с предшественником иодоацетата серина.
3. Синтез оставшейся аминокислотной последовательности:
После завершения синтеза коровой последовательности необходимо продолжить добавление оставшихся аминокислот, включая аминокислоты L- и D-типа. Добавление этих аминокислот необходимо начинать с основной последовательности, добавлять следующую аминокислоту в последовательности и использовать соответствующий конденсирующий агент для проведения химических реакций до тех пор, пока не будет синтезирована полная молекула полипептида GLP-1. Во время этого процесса также необходимо выбрать подходящую защитную группу по мере необходимости и выполнить этапы реакции, удаление защитной группы и добавление аминокислоты в последовательности.
4. Обработка гидроксидом натрия:
После добавления всех аминокислот на твердофазной смоле образуется не полностью синтезированная пептидная цепь, которую необходимо обработать для образования полностью сформированной пептидной молекулы. Во-первых, несформированный пептид следует гидролизовать гидроксидом натрия, чтобы С-концевая карбоксильная группа, изначально присоединенная к смоле, отсоединилась от смолы, а защитная группа отсоединилась в воде. После реакции гидролиза получают целевой продукт.
5. Осаждение и промывка:
После обработки гидролизат обрабатывают кислотой для осаждения целевого продукта. Далее осадок ресуспендировали в воде с последующей интенсивной промывкой от примесей.
6. Очистка:
Последним этапом является очистка целевого продукта, обычно с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Во время этого процесса чистота продукта может быть определена путем обнаружения пика раствора в масс-спектре. Короче говоря, химический синтез GLP-1 требует нескольких раундов сложных реакций и строгих процессов очистки, чтобы в конечном итоге получить активный целевой продукт.
Метод четвертый, биосинтез:
GLP-1 является важным полипептидным гормоном с различными физиологическими эффектами, включая стимулирование секреции инсулина, подавление аппетита, снижение массы тела и поддержание чувствительности к инсулину и т. д. Метод биосинтеза GLP-1 в основном синтезируется L-клетками. в поджелудочной железе, а скорость его синтеза регулируется приемом пищи. Подробные шаги представлены следующим образом:
1. Подготовительные работы перед синтезом:
Перед биосинтезом GLP-1 необходимо выполнить некоторую подготовительную работу, включая определение используемого типа клеток, настройку условий культивирования и выбор подходящего каталитического фермента. L-клетки являются основным источником синтеза GLP-1, поскольку они содержат предшественники двух гормонов, GIP (глюкагоноподобный пептид 1) и GLP-1. L-клетки можно выделить из эпителия кишечника кроликов или мышей. Перед биосинтезом клетки необходимо культивировать до достаточного количества, а также необходимо обеспечить достаточное количество питательных веществ и подходящие условия культивирования. Кроме того, необходимо выбрать соответствующий каталитический фермент для ускорения реакции.
2. Синтез и переработка прекурсоров:
Биосинтез GLP-1 в основном происходит в L-клетках, а его предшественник состоит из двух гормонов, GIP и GLP-1. После попадания в эндокринные клетки ГИП и ГПП-1 подвергаются процессингу протеолитическими ферментами и расщепляются на отдельные пептиды. В этом процессе участвует ряд ферментов и кофакторов, в том числе полипептидная ацидаза-предшественник (PC2), изомераза и факторы поздней адгезии.
3. Взаимная конверсия между полипептидными сегментами:
После обработки пептиды GIP и GLP-1 рекомбинируют с образованием полипептида GLP-1. Этот процесс требует использования глюкагоноподобного пептида 1 (GLP-1) в качестве матрицы, с которой объединяются другие отдельные пептиды для образования новых составных полипептидов. Этот процесс также требует некоторых специфических ферментов и факторов, в том числе прогормонконвертазы 1/3 (PC1/3) и карбоксипептидазы E (CPE).
4. Секреция GLP-1:
После синтеза и процессинга GLP-1 он сохраняется в цитоплазме и внутренних везикулах эндокринных клеток. При стимуляции диетой эндокринные клетки высвобождают ГПП-1 и попадают в кровоток через микрососуды. Этот процесс регулируется и контролируется с помощью ряда путей передачи сигнала, включая цАМФ-Ca.2 плюси так далее.
Короче говоря, биосинтез GLP-1 включает совместное действие множества звеньев и факторов. Сочетание биосинтеза и химического синтеза может обеспечить лучшую основу и поддержку исследований и производства GLP-1.
Метод пятый, ферментативный синтез:
Ферментативный синтез представляет собой синтез пептидных цепей посредством катализа биологических ферментов. По сравнению с традиционными методами жидкофазного синтеза, ферментативный синтез можно проводить при комнатной температуре, и можно выбрать широкий спектр сырья. Для катализа синтеза обычно используют такие ферменты, как тета-жидкостная синтаза, АЕР, АПФ и т.д.
В заключение, вышеупомянутые методы являются возможными методами синтеза GLP-1. Различные методы подходят для различных экспериментальных условий и условий фармацевтического производства.